سلام همکلاسی های عزیز

از اینکه همه رفتید پی خودتون و ما رو فراموش کردید سپاسگزاریم!

امروز با خبر شدم مرضیه خانم رتبه بسیار خوبی توی ارشد آورده. انشاالله که همه موفق باشید.

ای کاش یه قراری میذاشتیم تا دوباره همدیگرو ببینیم.... آرزو بر جوانان عیب نیست!

آزمایشگاه ژنتیک

آزمایشگاه ژنتیک

استخراج و الکتروفورز

مقدمه:

‌‌‌‌ استخراج ( اولين‌ قدم‌ در تحقيقات‌ ژنتيك‌ مولكولي‌ و مهندسي‌ ژنتيك‌ جداسازي‌ و خالص‌سازي DNA و RNA مي‌باشد.اهميت‌ استخراج DNA در اين‌ است‌ كه‌ يك‌ روش‌ سريع‌ و قابل‌ اعتمادي‌ براي‌ توليد خوبي‌ از DNA با وزن مولكولي‌ زياد و خالص از نمونه‌هاي‌ اخذ شده در دسترس باشد و براي‌ فرآوري‌ تعداد زيادي از نمونه‌ها جهت‌ انجام‌ آزمايشات‌ بتوان از اين روش استفاده گردد

امروزه دستورالعمل‌ها و كيت‌هاي‌ مختلفي‌ جهت‌ استخراج DNA در بازار وجود دارد كه‌ مبتني‌ بر روشهاي‌ مختلف‌ مي‌باشند اما در تمام‌ اينها اصول‌ كار به‌ ترتيب‌ زير مي‌باشد:

- ‌‌‌‌شكستن‌ سلول‌: از آنجايي‌ كه DNA و RNA در داخل‌ سلول‌ قرار دارند بنابراين، براي جداسازي‌ آنها بايد سلول‌ را شكست‌ كه‌ در مورد سلولهاي‌ جانوري‌ معمولاً با استفاده‌ از شوك ‌اسمزي‌ و يا دترجنتهاي‌ يوني‌ مثل SDS (سديم‌ دودسيل‌ سولفات) انجام مي‌گردد.

- ‌‌‌‌رسوب‌ دادن DNA و RNA: با شكسته‌ شدن‌ سلول‌ محتويات‌ آن كه‌ شامل DNA، RNA، پروتئين، چربي، قند و غيره است آزاد مي‌گردند كه از الكل سرد جهت رسوب DNA و RNA استفاده مي‌شود.

- ‌‌جدا كردن DNA و RNA: براي‌ اينكار در ابتدا از ميله‌ شيشه‌اي‌ (بدليل داشتن بار منفي) استفاده‌ مي‌شد كه DNA را جذب‌ مي‌كرد ولي‌ امروزه‌ از اتانل‌ در رسوب‌ اسيدهاي‌ نوكلئيك‌ استفاده‌ مي‌شود.

- رسوب‌ پروتئين‌ها: در DNA و RNA حاصل‌ از مراحل‌ قبل‌ ناخالص‌هايي‌ وجود دارد جهت‌ رسوب‌ پروتئين‌ها از فنل‌ و كلروفرم‌ و يا محلول‌ غليظ‌ نمكهاي‌ مختلف‌ استفاده‌ مي‌شود.

- ‌‌جداكردن DNA و RNA از يكديگر: در اين‌ مرحله‌ با توجه‌ به‌ هدف‌ كار از آنزيم‌هاي DNAse و RNAse استفاده‌ مي‌شود. اما در روش‌هاي‌ جديد با توجه‌ به‌ هدف، مسير استخراج‌ يا مواد شيميايي‌ را تغيير مي‌دهند

 

الکتروفورز (به انگلیسی: Electrophoresis) به حرکات ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی گویند. به سبب اینکه ماکرومولکول‌های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین‌ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود. روش‌های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول‌ها اعم از اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین‌ها ابداع شده‌است از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می‌شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته می‌شود. به منظور بررسی پروتئین‌ها با استفاده از PAGE، به سبب اینکه پروتئین‌ها دارای بار مختلف هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه می‌شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین‌ها شده و به آنها متصل می‌شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول‌های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید.

برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می‌شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر وآسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می‌گیرد. معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ‌تر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات DNA تک رشته‌ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌شود. قدرت تفکیک ژل‌های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳٪ و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگارز ۸/۰ ٪ استفاده می‌شود. در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود. به این نوع ژل‌ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب‌های اسیدهای نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول‌ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود. در این ژل‌ها مولکول‌های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول‌های بزرگ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی دی‌ان‌ای استفاده می‌شود.

مواد و وسایل لازم:

 الف)استخراج ژن :مایع غلیظ حاوی بافت متلاشی شده ی کبد مرغ،NaClO₆  7.5 مولار، کلروفرم، ایزوآمیل الکل، اتانول سرد، بافر Tris Cl 0.01 مولار، لوله آزمایش، دستگاه سانتریفوژ

ب) الکتروفورز: ژل آگاروزی، محلول آبی رنگ( بروموفنل و گلیسرول)، دستگاه الکتروفورز

 

روش کار:

الف)استخراج:  غلیظ حاوی بافت متلاشی شده ی کبد مرغ در اختیار ما قرار گرفت. به آن سه قطره پرکلرات سدیم 7.5 مولارمی افزاییم. در این مرحله DNA و هیستون ها از یکدیگر جدا می شوند. سپس به اندازه ی یک حجم از مخلوط کلروفرم و ایزو آمیل الکل به نمونه اضافه کرده درب آن را بسته و در تیوب را بین انگشتان اشاره و سبابه قرار داده و در زاویه 90 درجه با آرامی می‌چرخانیم. شدت بهم زدن باید طوری باشد که پس از چندین بار مخلوط کردن رنگ محلول شیری رنگ شود. سپس بهم زدن را برای لحظاتی دیگر ادامه داده تا عمل شستشو بطور کامل صورت گیرد. نمونه را به مدت 20 دقیقه داخل سانتریفوژ قرار می دهیم. بعد از خارج نمودن نمونه بایستی سه فاز در آن مشاهده شود. فاز بالایی(فاز آبی) که شفاف بوده و حاوی DNA می‌باشد، فاز وسط که حجم آن نسبت به دو فاز دیگر خیلی کمتر بوده و حاوی پروتئین است و فاز سوم که در ته تیوب بوده و تیره رنگ می‌باشد و شامل کلروفرم و ایزو آمیل الکل و کلیه مواد آلی و معدنی موجود در عصاره ی کبد می‌باشد. فاز بالايي بدقت برداشته شده و به تیوب تمیز دیگری منتقل می‌شود. بایستی دقت کافی بعمل آید تا از مخلوط شدن فازهای دیگر بخصوص فاز وسط، جلوگیری بعمل آید. فاز وسط حالت ژله‌ای داشته و تمایل دارد که به داخل فاز اول مکیده شود. لازم نیست که کل فاز اول برداشته شود چرا که این کار عملاً غیر ممکن بوده و خطر آلودگی با سایر فازها را در بر دارد. معمولا حدود 80-70 درصد از فاز اول برداشته می‌شود. به فاز جدا شده اتانول سرد اضافه می کنیم تا رسوب DNA ایجاد شود. پس از آن نمونه را دوباره به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ کرده و مایع رویی را جدا می نماییم. در آخر 1میلی لیتر  بافر Tris Cl 0.01 مولار به نمونه می افزاییم.

ب) الکتروفورز:

مقداری از DNA را با حدود10 میکرولیتر از محلول آبی رنگ مخلوط کرده  و با میکروپیپت دیگری آن را داخل چاهک ژل آگاروز می ریزیم. دستگاه الکتروفورز را روشن کرده و منتظر می مانیم تا جداسازی قطعات مولکولی انجام شود. این قطعات بر اساس اندازه از یکدیگر تفکیک می شوند. در آخر ژل را از تانک خارج کرده و با نور UV مشاهده می کنیم.

 

 

 

آزمایشگاه ژنتیک

نام آزمايش:مشاهده کروماتین جنسی: barr body

مقدمه: بار و برترام در سال 1949 در هسته ي نورون هاي گربـه ي مـاده يك جـسم كوچـك با رنگ آميزي تيره ، چسبيده به هستك يا غشاء هسته را كشف كردند. اين جسم به ندرت در سلول هاي مشابه گربه هاي نر ديده شد. مطالعات بعدي نشان داد كه اين دو شكلي جنسي در سلول هاي بيشتر بافت هاي پستانداران كيسه دار ، جفت سمان ، خفاشيان ، گوشتخواران و نخستيها وجود دارد. اين جسم كروماتين كه خاص سلول هاي ماده است و در جنس نر وجود ندارد، امروزه تحت عنوان كروماتين جنسي يا جسم بار به پاس نام كاشف آن شناخته مي شود. در سلول هاي غير از نورون ها اين جسم كروماتيني( با ابعاد حدود mµ1) نوعا يك شكل محدب دارد كه در كناره ي سطح داخل غشاي هسته جاي مي گيرد. شواهد قابل ملاحظه اي نشان مي دهد كه كروماتين جنسي كروموزومX غير فعال شده است. در سلول ها طبيعي كه تنها يك كروموزومX  دارند ، جسم بار ديده نمي شود. در سلول هاي زن طبيعي كه دو كروموزومX وجود دارد، در هر هسته يك جسم بار ديده مي شود. در حالي كه در سلول هاي زن با سه كروموزوم X  دو كروماتين جنسي وجود دارد

  جسم كروماتين كه در هسته ي انترفاز سلول هاي زنان طبيعي ديده مي شود از غير فعال شدن بخش عمده ي يكي از دو كروموزومX پديد مي آيد.     

مواد و وسایل لازم: رنگ استواورسئین. لام ، لامل

روش آزمایش: جسم بار یا کروماتین جنسی در هر بافتی که سلول های درشت و هسته باز داشته باشد، ممکن است دیده شود.برای این منظور می توان از سلول های مخاط دهان استفاده کرد. در ابتدا پیش از تهیه ی لام باید دهان را برای کاهش باکتری های دهانی و کاهش چسبندگی بزاق با آب شست و شو داد.  سپس توسط یک دستمال کاغذی تمیز سطح داخل گونه را خشک نمود.

 با کشیدن لامل به سطح داخلی گونه لایه ای از سلول های مخاطی دهان را برداشته و آن را روی لام گذاشته و در تمام سطح لام پخش می کنیم تا به کمک جریان هوا خشک شود. پس از خشک شدن لام روی آن چند قطره استواورسئین ریخته تا هسته سلول رنگ بگیرد. سپس لامل را روی آن قرار می دهیم و نمونه را ابتدا با بزرگنمایی 40 سپس به کمک روغن با بزرگنمایی 100 مشاهده می کنیم.

سوال: اگر 2 يا 3 عدد جسم بار در سلول باشد احتمال مي دهيد تركيب كروموزوم هاي جنسي چه باشد و تعداد كل كروموزوم در سلول هاي سوماتيك چند عدد است؟

تعداد اجسام بار در هسته سلول برابر است با :   1-تعداد Xها ، بنابر این با آزمایش جسم بار می توان ناهنجاری های تعداد کروموزوم X را تشخیص داد. زن های طبیعی دارای یک جسم بار در سلول های اینترفازی هستند. ولی مردهای طبیعی فاقد جسم بار می باشند و بر این اساس افراد ترنر (XO-45تا) فاقد جسم بار، افراد کلاین فلتر(XXY-47تا) دارای یک جسم بار و افاد(XXX-47تا) دارای دو جسم بار در سلول های اینترفازی هستند.

آزمایشگاه ژنتیک

نام آزمایش:تشخیص جنسیت در مگس سرکه

مقدمه :

در این آزمایش از مگس سرکه, Fruit Fly  و یا Drosphila Melangaster  استفاده نمودیم . علت استفاده نیز به دلیل مختلفی به شرح زیر می باشد :

1) نگهداری و پرورش مگس سرکه در شرایط آزمایشگاهی آسان بوده و هزینه ی زیادی ندارد.

2) دوره ی تکامل لاروی مگس سرکه کوتاه مدت است و در مدت 11 روز نسل جدیدی را بوجود می آورد

3) مگس های ماده در طی دوره ی زندگی خود به دفعات متعدد تخم ریزی می نماید و تعداد تخم ها در هر دوره تخم ریزی نسبتآ زیاد است.

4) با در نظر گرفتن تعداد کروموزوم ها مطالعات صفات نسبت به سایر موجودات آسان تر است.

5) عملی نمودن این آزمایش ها نیاز به وسایل پیچیده نداشته و ضمن آنکه مقالات بیشماری در این ضمینه وجود دارد...

  شرح آزمایش :

       ابتدا مگس ها را  بیهوش کرده و زیر لوپ قرار داده و پس از مشاهده , به تشخیص جنسیت در مگس های سرکه پرداختیم :

از روی شکل و ظاهر مگس های سرکه کاملا می توان به جنسیت آن ها پی برد بطوری که

مگس های سرکه ی نر :

·        دارای انتهای شکمی گرد می باشد

·        بندهای شکمی کمتری نسبت به ماده دارند (5 عدد)

·        دارای تارچه هایی سیاه و سخت بر روی سطح قسمت انتهایی اولین بند تارسوس در پاهای قدامی می باشد که به این تارچه ها سکس کامب(Sex Comb) می گویند.

مگس های سرکه ی ماده :

. جثه ی بزرگ تری نسبت به مگس های نر دارند.

·        دارای انتهای شکمی کشیده می باشد

·        بند های بیشتری نسبت به جنس نر دارد ( 7 عدد) .

·        ناحیه ی شکمی با گذشت زمان و بالغ شدن تخم ها بسط پیدا کرده و بزرگتر می شود.

فاقد سکس کامب هستند ( Sex Comb)

 

ژنتیک

---

موضوع آزمایش: کروموزوم های پلی تن

هدف آزمایش:مشاهده کروموزوم های غول پیکر در لارو دروزوفیل

مقدمه: هر کروموزوم معمولی یوکاریوتی تنها حاوی یک مولکول DNA است . درسلول های غدد بزاقی و بعضی بافت های لارو دروزوفیل و حشرات دوبال(Dipteran) کروموزوم های غول پیکری به نام کروموزوم های پلی تن وجود دارد و به دانشمندان کمک می کند تغییرات ژنتیکی را بررسی کنند. . این کروموزوم از تقسیمات سلولی ایجاد می شود که طی آن DNA همانند سازی می کند ولی تقسیم هسته و سلول صورت نمی گیرد. با قرار گرفتن DNAها در کنار هم اجتماع غول پیکری از 1000 مولکول DNA حاصل می شود که با میکروسکوپ نوری قابل مشاهده است.

  در حالت عادی کروموزوم ها در سلول جدا هستند. ولی در سلول های پلی تن  کروموزوم ها از ناحیه ی سانترومر به هم متصل می شوند و یک رشته ی بزرک و ضخیم را تشکیل می دهند و به محل اتصال سانترومر ها که حجیم شده است، کروموسانترومر می گویند. کروموزوم موجود در غدد بزاقی مگس سرکه دارای چندین بازوست. در سلول به ازای هر کروموزوم، یک کروموزوم همتا (همولوگ) وجود دارد. در کروموزوم پلی‌تن کروموزوم‌های همتا از هم جدا نیستند بلکه این کروموزوم متصل و در جوار کروموزوم اصلی است (کروموزوم‌های همولوگ در کنار هم هستند)

در مگس سرکه کروموزوم‌های بزرگ شماره 2 و 3، متاسانتریک هستند (سانترومر در مرکز قرار دارند) در نتیجه هر یک دارای دو بازو راست و چپ هستند. کروموزوم‌های 4 و X بازویی ندارند چون سانترومر آن‌ها در انتهای کروموزوم قرار دارند و تلوسانتریک هستند. کروموزوم Y به صورت هتروکروماتینی است و در منطقه کروموسانترومر قرار دارد در نتیجه دیده نمی‌شود

نوار ها و بند هایی که در طول کروموزوم های پلی تن پس از رنگ آمیزی مشاهده می شود ز نظر رونویسی ژن ها غیر فعال یا کمتر فعال هستند.وجود نوارهای منظم نقش مهمی در بررسی جایگاه فیزیکی ژن ها داشته است. در طول کروموزوم های پلی تن مناطق متورمی به نام پاف(Puff) وجود دارد که مناطق فعال از نظر رونویسی هستند به طوری که 10درصد نوار ها به حالت پاف هستند.

مواد و وسایل لازم: لارو دروزوفیل، سوزن، استوکارمن، کاغذ خشک کن، لوپ، میکروسکوپ نوری، لام و لامل

شرح آزمایش: دوره ی رشد و نمو لارو دروزوفیل در یک دوره ی 8 تا 10 روزه پس از لقاح و تخم گذاری است. طول این دوره را شرایط محیطی از جمله درجه ی حرارت تعیین می کند. در دره ی حرارت پایین رشد و نمو لارو کند تر است.

   ابتدا لارو را در یک قطره آب روی لام قرار دادیم و زیر لوپ بررسی کردیم. در زیر لوپ با یک سوزن انتهای بدن لارو را نگه داشته و با سوزنی دیگر را در قلاب دهانی بخش پیشین بدن فرو کرده و غدد بزاقی را به همراه احشاء داخلی بیرون کشیدیم .غدد بزاقی که به شکل دو کیسه  نقره ای رنگ با یک نوار سفید چربی روی آن است در زیر لوپ قابل تشخیص از سایر بافت ها و اندام هاست. آن را با سوزن جدا کرده و بقیه ی بافت ها غیر از غدد بزاقی را از لام خارج می کنیم. باید مراقب باشیم که آب همراه نمونه خشک نشود.

 

با کاغذ خشک کن مقداری از آب روی نمونه را خشک کرده و بلافاصله استوکارمن را روی نمونه می ریزیم.    به مدت 10تا15 دقیقه صبر می کنیم تا نمونه رنگ بگیرد.

  پس از رنگ گرفتن هسته ی سلول های غدد بزاقی توسط یک کاغذ خشک کن با انگشت محکم روی لامل فشار می دهیم تا ضمن گرفتن رنگ های اضافی با پاره شدن غشای هسته بازوهای کروموزوم های پلی تن از یکدیگر جدا و قابل تشخیص شوند. حال با استفاده از میکروسکوپ نوری کروموزوم های پلی تن را بررسی می کنیم. 

چرا کروموزوم های پلی تن بوجود می آیند و سریع وارد چرخه ی سلول می شوند؟

برای افزایش حجم سلول، برخی از سلول های تخصصی تحت مضاعف شدن پی در پی DNA بدون تقسیم سلولی، تشکیل یک فرم بزرگ به نام کروموزوم پلی تن را می دهند.به دلیل اینکه غدد بزاقی لارو باید آنزیم ها  و پروتئین های زیادی تولید کند، پس باید مقدار فراوانی mRNA داشته باشد. این مقدار فراوان با غول پیکر شدن کروموزوم تولید می شود.

غدد بزاقی لارو مگس سرکه

---

          

  کروموزوم های پلی تن

آزمایشگاه میکرب شناسی

آزمون های IMViC

به علت کمبود وقت به طور مختصر این تست را می توضیحم.

شامل ۴ تست است.

اندول---- محیط کشت مایع است. پس از کشت باکتری در صورتی که باکتری اندول مثبت باشد یعنی تریپتوفان موجود در محیط کشت را تجزیه کند با ریختن چند قطره معرف کواکس رنگ قرمزی حد فاصل محیط کشت و معرف دیده می شود

 

آزمون mr-vp شامل دو آزمون متیل رد و وگس پروسکوئر است. در میحط کشتmr-vp باکتری را کشت و رشد باکتری در این محیط مقداری از آن را به لوله ی دیگری منتقل می کنیم. در یک لوله معرف متیل رد اضافه کرده و اگر قرمز تندی ایجاد شد مثبت است .

 

 در دیگری  برای انجام تست vpچند قطره محلولA و چند قطره محلولB اضافه می کنیم. اگر صورتی تندی ایجاد شد مثبت است

تست بعدی سیترات است.محیط کشت سیترات آگار محیطی شیبدار است. باکتری ها از سیترات سدیم به عنوان منبع کربن استفاده می کنند. در صورتی که باکتری از سیترات به عنوان منبع استفاده کرده باشد محیط از سبز به آبی تغییر خواهد کرد

آزمایشگاه میکرب شناسی

بسمه تعالی

رنگ آمیزی گرم

ابزار و مواد مورد نیاز: لوپ حلقوی، لام، گیره، سینی رنگ آمیزی، پلیت حاوی باکتری ، لوگول ، کریستال ویوله، سافرانین ، الکل- استن،متیلن بلو

     ابتدا لوپ حلقوی را روی شعله گرفتیم تا عاری از باکتری شود ، یک قطره آب روی لام قرار می دهیم. به وسیله لوپ مقداری از باکتری های کشت شده را از پلیت برداشته (این کار کنار شعله انجام می گیرد) و در قطره آب روی لام حل می کنیم. پس از این کار لام را کنار می گذاریم تا خشک شود.

    سپس لام آماده را روی سینی رنگ آمیزی قرار می دهیم. چند قطره کریستال ویوله روی باکتری ها ریخته و به مدت تقریبا یک دقیقه صبر کردیم .پس از شستشوی با آب ، کریستال ویوله را با افزودن لوگول به مدت یک دقیقه تثبیت کردیم.( لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس‌هایی می‌نماید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می‌شود). پس از این مدت لام را با آب شستشو می دهیم.

    الکل استون را قطره قطره میریزیم و دوباره با آب شست و شو می دهیم. در باکتری های گرم منفی که دارای لایه ها ی پپتیدی و گلیکان محدود و غشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه در غشا می شود و باکتری رنگ مـراحل قبل خود را از دست می دهد. ولی در گرم مثبت به علـت ضخامت زیاد لایه ی پپتیدو گلیکان و عدم وجود لیپید فراوان در غشا ، رنگ مرحله ی قبل باقی می ماند.

    در آخر پس از شستشوی لام با آب سافرنین را اضافه می کنیم که به مدت 30 ثانیه روی آن باید قرار بگیرد . پس از این کار لام را با آب شستشو دادیم و پس از خشک شدن با میکروسکوپ بررسی کردیم

باکتری های گرم مثبت آبی و گرم منفی قرمز دیده می شود.

بسمه تعالی

رنگ آمیزی اسپور به روش شفر -فولتون

مواد و وسایل مورد نیاز:سوسپانسون میکربی. مالا شیت گرین. کاغذ صافی. سافرانین

   نمونه ی میکربی را برداشته و از آن روی لام سوسپانسون تهیه می کنیم و می گذاریم تا در محیط آزمایشگاه خشک شود. سپس آن را روی شعله فیکس کرده و روی تشتک بخار قرار می دهیم.

کاغذ صافی را روی لام قرار داده و بعد مال شیت گرین را به مدت 3 دقیقه روی آن می ریزیم ( در صورتی که رنگ در حال خشک شدن باشد باید دوباره رنگ اضافه کرد ). بعد از شست و شو با آب سافرانین را به مدت یک دقیقه روی آنها ریخته و دوباره با آب شست و شو می دهیم.

در این روش باکتری های مولد هاگ بررسی می شوند. هاگ ها به صورت بخش های کوچک گرد و یا بیضی سبز رنگ و سلول رویشی میله ای به رنگ قرمز مشاهده می شود.

بسمه جلت اسمائه

رنگ آمیزی کپسول

بعضی از باکتریها ماده لزجی از خود ترشح می کنند که خارج از سلول و پیرامون آن جمع می شود و دیواره سلولی را می پوشاند . این لایه کپسول نامیده می شود که ضخامتهای متفاوت و چسبندگی متغیر دارد. اندازه کپسول به محیط کشت میکروبی بستگی دارد و همچنین باکتریهای بیماریزا ، در بین باکتریهای تولید کننده کپسول ،انواع بیماری زا  کپسولهای بزرگتری دارند. جنس این کپسول از پلی ساکارید است که در آب محلول و غیر یونی است .

رنگ آمیزی کپسول رنگ آمیزی منفی است یعنی هر چیزی رنگ می شود به جز ساختاری که هدف مشاهده ی آن است.مراحل آن به شرح زیر است:

یک قطره نگروزین(مرکب چین) را با پیپت پاستور گوشه ی لام قرار می دهیم و در کنار این قطره یک قطره از سوسپانسون میکربی می گذاریم. این دو قطره را با هم مخلوط کرده و توسط لام دیگر با زاویه ی ۴۵ درجه روی این لام می کشیم به طوری که لایه ی نازکی از رنگ روی لام باشد. سپس می گذاریم تا در هوای آزمایشگاه خشک شود. در این آزمایش نیازی به فیکس کردن نیست چون تثبیت با حرارت ساختمان  سلول داخل کپسول را از شکل طبیعی خارج می کند( عکس پیدا نکردم !)

آزمایش: کشت خطی باکتری روی محیط کشت

هدف: رقیق کردن باکتری ها و تهیه ی کلنی های تکی و خالص از باکتری ها

وسایل مورد نیاز: محیط کشت  EMBو MACاستریل- محیط کشت حاوی باکتری - لوپ

شرح آزمایش: ابتدا به وسیله ی لوپ سترون شده مقداری باکتری از محیط کشت برداشتیم و به صورت خط های زیگزاگ بدون اینکه دستمان را برداریم در چند جهت کشیدیم. در منطقه ی دوم از انتهای خط انتهایی منطقه ی اول در جهت دیگر ادامه دادیم. همین طور در چند منطقه ی دیگر ادامه می دهیم. خصوصیت این روش این است که وقتی خطوط زیگزاگ را روی سطح می کشیم ، به ترتیب از تراکم باکتری ها کاسته می شود. در آخر لـوپ را به شکل Z روی محـیط کـشیده و چندین نقطه مـی گذاریم

 

.

نتیجه: درسطح محیط کشت مک کانکی به صورت کلنی های لاکتوز مثبت صورتی رنگ مسطح وخشك رشد می کند

    در محیط کشت EMB کلنی های باکتری های لاکتوز مثبت بنفش و دارای جلای فلزی است در حالی که کلنی های باکتری های لاکتوز منفی فاقد این جلا است.

 

 

بسم الله الرحمن الرحیم

 سلام  از آنجایی که به ایام امتحانات نزدیک شده ایم  تصمیم گرفتم مطالبی را به صورت خلاصه از آزمایشگاه میکرب بنویسم چون خودم این مطالب را از سایت ها و کتاب های مختلف جمع آوری کرده  و به صورت گزارشکار تحویل استاد داده ام امکان خطا و اشتباه در آن وجود دارد پس تقاضا می کنم برای رفع نواقص و خطاها حتما نظر دهید       .

آزمایشگاه میکرب شناسی عمومی

جلسه ی اول

آزمایش:تکنیک قطره ی معلق، رنگ آمیزی ساده(متیلن بلو)

وسایل و مواد مورد نیاز: لام مخصوص گودی دار، لامل، آب یونجه،وازلین،متیلن بلو، لوپ حلقوی، محیط کشت حاوی باکتری تشتک رنگ آمیزی

شرح آزمایش: 1- در قطره ی معلق یک قطره آب یونجه حاوی میکرب در زیر لامل چسبیده و بر روی لام های مخصوص که در وسطشان یک گودی وجود دارد قرار می گیرد. قطره بدون آنکه با لام تماس پیدا کند از لامل آویخته است. قطره ی معلق به شرح زیر تهیه می گردد:

  الف-لامل را با روغن(وازلین)حاشیه می دهند- می توان اطراف گودی لام را هم آغشته به روغن نمود- ب- یک قطره از نمونه بر سطح لامل قرار داده می شود. ج- لام گوده دار را روی لامل نهاده طوری که قطره داخل گودی لام قرار گیرد. لام را روی لامل فشار می دهند تا به کمک حاشیه ی روغن دار لامل به آن متصل شود. د- سپس لام را برگردانیده به طوری که قطره زیر لامل معلق مانده و با لام تماس پیدا نکند.

     در آخر نمونه را زیر میکرسکپ مشاهده می کنند

    2- رنگ آمیزی ساده باکتری: روی لام یک قطره آب ریخته و با لوپ از محیط کشت مقداری میکرب برمی داریم و سوسپانسیون می سازیم بعد منتظر می مانیم تا در هوای آزمایشگاه خشک شود و لایه ی سفیدی روی لام ایجاد شود. سپس لام را دو تا سه بار از روی شعله عبور می دهیم تا باکتری ها روی لام فیکس شوند( باید حواسمان باشد تا لام به قدری داغ نشود که باکتری ها بسوزند). لام را روی تشتک رنگ آمیزی قرار داده و آن را با محلول متیلن بلو آغشته می کنیم. پس از یک دقیقه با آب شست و شو داده و  می گذاریم تا خشک شود.با میکرسکپ می توان باکتری های رنگ آمیزی شده را مشاهده کرد.